2021年超滤管使用方法和注意项目超滤管使用方法和注意事项蛋白浓缩和换Buffer通常使用超滤管，常见MilliporeAmicon-Ultra-15超滤管（MWCO10kD）。也有型号、不一样体积大小和MWCO超滤管可选，视目标蛋白分子量和浓缩前体积、浓缩目标体积而定。可反复使用，使用一次就扔掉太浪费。以下是个人总结使用方法和注意事项。1、选择适宜超滤管，关键考虑MWCO和浓缩体积，最常见是Ultra-15（10kD）。到底选择多大截留分子量比较适宜呢？10kDa、5kDa、还是30kDa？通常应截留分子量不应大于目标蛋白分子量1/3尊龙凯时2021年超滤管使用方法和注意项目，比如目...

　　和注意事项蛋白浓缩和换Buffer通常使用超滤管，常见MilliporeAmicon-Ultra-15超滤管（MWCO10kD）。也有型号、不一样体积大小和MWCO超滤管可选，视目标蛋白分子量和浓缩前体积、浓缩目标体积而定。可反复使用，使用一次就扔掉太浪费。以下是

　　使用方法和注意事项。1、选择适宜超滤管，关键考虑MWCO和浓缩体积，最常见是Ultra-15（10kD）。到底选择多大截留分子量比较适宜呢？10kDa、5kDa、还是30kDa？通常应截留分子量不应大于目标蛋白分子量1/3，比如目标蛋白分子量为35kDa，就能够选择10kDa截留分子量超滤管。若目标蛋白分子量为10kD左右，则能够用截留分子量3kD超滤管。认真阅读使用说明书，注意超滤膜对多种化学物质耐受程度有所不一样，表格中有。2、新买来超滤是干燥，使用前加入MilliQ水，水量完全过膜，冰浴或冰箱里预冷几分钟。然后将水倒出，即可加入蛋白液，加入多少，以不超出管顶白线为准。操作要轻，加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。3、平衡。质量和重心二者全部要达成平衡。注意转速和加速度不可太快，不然直接损坏超滤膜。开始离心超滤（离心机预冷至4度）。不一样离心机转速rpm换算成g以后，有所不一样。具体可参阅附件里说明书。离心机加速度调至最低级，减小对膜压力。注意，一定要等离心机达成目标转速以后，方可离开离心机，不然离心机出问题时，无法第一时间处理，后果不可估计！膜和转轴方向根听说明书调整（角转离心机情况是膜和轴垂直）。在实际使用中，通常转速开比说明书里要低，这么能够延长离心管使用寿命。4、当浓缩到剩下1ml时，【取50ul国产Bradford溶液，加入10ul流穿，看有没变蓝色，以此判定超滤管是否遗漏蛋白。假如管漏了，将上层和流穿重新倒入新管中开始超滤。要正确判定是否漏管，用5mg/mlBSA离心10min，再取流穿尊龙凯时，跑蛋白胶或Bradford粗测】，继续加入剩下蛋白液浓缩（在冰上操作，预防蛋白受热），直到全部浓缩液全部加完为止。离心过程中注意是否发生蛋白沉淀，造成堵管。若发生沉淀，要确定沉淀具体原因，是蛋白浓度过高还是Buffer不适宜；前者可用多根超滤管同时超滤，降低浓度措施处理，后者方法是换不一样Buffer，直到蛋白不发生沉淀为止。5、前面几步用以浓缩蛋白，假如要换Buffer，在总蛋白液浓缩至1ml左右时候，轻轻加入新Buffer（经0.22um超滤膜超滤），再浓缩至1ml左右，连续三次，最终一次浓缩终体积依据需要蛋白浓度而定，通常不多于500ul，也有浓缩至200ul以内情况。根据每次最少10倍左右体积浓缩算，三次达成1000倍以上，基础上能够达成换buffer目标。6、取出最终蛋白浓缩液操作在冰上操作，用黄枪头（200ul）取，轻轻顺着边缘插入枪头，轻轻吹打、混匀蛋白液，注意不要碰到超滤膜，然后吸收浓缩液，每次吸靠近200ul，直到吸完。管底剩下最终一点浓缩液无须吸收，不然难度太大，有可能损坏超滤膜。最终加入MilliQ水到超滤管中，没过超滤膜，预防膜失水变干。7、以下是处理超滤管，反复利用超滤管步骤。8、倒出超滤管里水，用milliQ水轻轻润洗几次，【若管底有可见蛋白沉淀，能够先加入水，然后用枪头吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉淀悬起，然后倒掉，不可用自来水猛冲】然后加入0.2MNaOH溶液，室温放置20min，期间平衡超滤管。再离心10min。倒出残留NaOH溶液，将管芯浸入MilliQ水烧杯(1或2L)中,放置多个小时,再换新水,放置多个小时，不停稀释NaOH浓度。50ml管和盖子用自来水洗，内壁再用MilliQ水洗洁净。9、取出浸没管芯，加至靠近满MilliQ水，50ml管也加满MilliQ水，将管芯慢慢放入50ml离心管，排出部分水，然后盖上盖子，放4度保留，直到下次使用。通常来说，根据上述步骤和注意事项，每根管用三四年不会坏。试验室常见储存液配置参数1．30%丙烯酰胺溶液【配制方法】将29g丙烯酰胺和1gN，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml水中。加热至37℃溶解之，补加水至终体积为100ml。用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，查证该溶液pH值应小于7.0，置棕色瓶中保留于室温。【注意】丙烯酰胺含有很强神经毒性并能够经过皮肤吸收，其作用具累积性。称量丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺时应戴手套和面具。可认为聚丙烯酰胺无毒，但也应谨慎操作，因为它还可能会含有少许未聚合材料。部分价格较低丙烯酰胺和双丙烯酰胺通常含有部分金属离子，在丙烯酰胺贮存液中加入大约0.2体积单床混合树脂（MB-1Mallinckrodt），搅拌过夜，然后用Whatman1号滤纸过滤以纯化之。在贮存期间，丙烯酰胺和双丙烯酰胺会缓慢转化成丙烯酰和双丙烯酸。2．40%丙烯酰胺【配制方法】把380g丙烯酰胺（DNA测序级）和20gN，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为600ml蒸馏水中。继续按上述配制30%丙烯酰胺溶液方法处理，但加热溶解后应以蒸馏水补足至终体积为1L。【注意】见上述配制30%丙烯酰胺说明，40%丙烯酰胺溶液用于DNA序列测定。3．放线菌素D溶液【配制方法】把20mg放线%乙醇作空白对照读取OD440值。放线）纯品在水溶液中摩尔消化系数为21，900，故而1mg/ml放线，放线菌素D贮存液应放在包有箔片试管中，保留于-20℃。【注意】放线菌素D是致畸剂和致癌剂，配制该溶液时必需戴手套并在通风橱内操作，而不能在开放在试验桌面上进行，谨防吸入药粉或让其接触到眼睛或皮肤。药厂提供作诊疗用途放线菌素D制品常含有糖或盐等添加剂。只要经过测量贮存液在440nm波优点光吸收确定放线菌素D浓度，这类制品便可用于抑制本身引导作用。4．0.1mol/L腺苷三磷酸（ATP）溶液【配制方法】在0.8ml水中溶解60mgATP,用0.1mol/LNaOH调至pH值至7.0，用蒸馏水定容1ml，分装成小份保留于-70℃5．10mol/L乙酸酰溶液【配制方法】把770g乙酸酰溶解于800ml水中，加水定容至1L后过滤除菌。6．10%过硫酸铵溶液【配制方法】把1g过硫酸铵溶解于终量为10ml水溶液中，该溶液可在4℃保留数周。7．BCIP溶液【配制方法】把0.5g5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐（BCIP）溶解于10ml100%二甲基甲酰胺中，保留于4℃8．2×BES缓冲盐溶液【配制方法】用总体积90ml蒸馏水溶解1.07g盐溶液BES[N，N-双（2-羟乙基）-2-氨基乙磺酸]、1.6gNaCl和0.027gNa2HPO4，室温下用HCl调整该溶液pH值至6.96、然后加入蒸馏水定容至100ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成小份，保留于-20℃。9．1mol/LCaCl2溶液【配制方法】在200ml蒸馏水中溶解54gCaCl2?6H2O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成10ml小份贮存于-20℃。 【注意】制备感受态细胞时，取出一小份解冻并用蒸馏水稀释至100ml，用Nalgene滤器（0.45μm孔径）过滤除菌，然后骤冷至0℃。10．2.5mol/LCaCl2溶液【配制方法】在20ml蒸馏水中溶解13.5gCaCl2?6H2O，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。11．1mol/L二硫苏糖醇（DTT）溶液【配制方法】用20ml0.01mol/L乙酸钠溶液（pH5.2）溶解3.09gDTT，过滤除菌后分装成1ml小份贮存于-20℃。【注意】DTT或含有DTT溶液不能进行高压处理。12．脱氧核苷三磷酸（dNTP）溶液【配制方法】把每一个dNTP溶解于水至浓度各为100mmol/L左右，用微量移液器吸收0.05mol/lTris碱分别调整每一dNTP溶液pH值7.0（用pH试纸

　　），把中和后每种dNTP溶液各取一份作合适稀释，在给出波长下读取光密度计算出每种dNTP实际浓度，然后用水稀释成终浓度为50mmol/LdNTP，分装成小份贮存于-70℃。13．0.5mol/lEDTA(pH8.0)溶液【配制方法】在800ml水中加入186.1g二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na?2H2O），在磁力搅拌器上猛烈搅拌，用NaOH调整溶液pH值至8.0（约需20gNaOH颗粒）然后定容至1L，分装后高压灭菌备用。【注意】EDTA二钠盐需加入NaOH将溶液pH值调至靠近8.0，才能完全溶解。14．溴化乙锭（10mg/ml溶液）【配制方法】在100ml水中加入1g溴化乙锭，磁力搅拌数小时以确保其完全溶解，然后用铝箔包裹容器或转移至棕色瓶中，保留于室温。【注意】小心：溴化乙锭是强诱变剂并有中度毒性，使用含有这种染料溶液时务必戴上手套，称量染料时要戴面罩。15．2×HEPES缓冲盐溶液【配制方法】用总量为90ml蒸馏水溶解1.6gNaCl、0.074gKCl、0.027gNa2PO4?2H2O、0.2g葡聚糖和1gHEPES，用0.5mol/lNaOH调整pH值至7.05，再用蒸馏水定容至100ml。用0.22μm滤器过滤除菌，分装成5ml小份，贮存于-20℃。16．IPTG溶液【配制方法】IPTG为异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（分子量为238.3），在8ml蒸馏水中溶解2gIPTG后，用蒸馏水定容至10ml，用0.22μm滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于-20℃。17．1mol/L乙酸镁溶液【配制方法】在800ml水中溶解214.46g四水乙酸镁，用水定容至1L过滤除菌。18．1mol/LMgCl2溶液【配制方法】在800ml水中溶解203.4gMgCl2?6H2O，用水定容至1L，分装成小份并高压灭菌备用。【注意】MgCl2极易潮解，应选购小瓶（如100g）试剂，启用新瓶后勿长久存放。19．β-巯基乙醇（BME）溶液【配制方法】通常得到是14.4mol/L溶液，应装在棕色瓶中保留于4℃。【注意】BME或含有BME溶液不能高压处理。20．NBT溶液【配制方法】把0.5g氯化氮蓝四唑溶解于10ml70%二甲基甲酰胺中，保留于4℃。21．酚/氯仿溶液【配制方法】把酚和氯仿等体积混合后用0.1mol/LTris?HCl(pH7.6)抽提几次以平衡这一混合物，置棕色玻璃瓶中，上面覆盖等体积0.01mol/lTris?HCl(pH7.6)液层，保留于4℃。【注意】酚腐蚀性很强，并可引发严重灼伤，操作时应戴手套及防护镜，穿防护服。全部操作均应在化学通风橱中进行。和酚接触过部位皮肤应用大量水清洗，并用肥皂和水洗涤，忌用乙醇。22．10mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）溶液【配制方法】用异丙醇溶解PMSF成1.74mg/ml（10mmol/L），分装成小份贮存于-20℃。如有必需可配成浓度高达17.4mg/ml贮存液（100mmol/L）。【注意】PMSF严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或经过皮肤吸收后有致命危险。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。凡被PMSF污染衣物应予丢弃。PMSF在水溶液中不稳定。应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。PMSF在水溶液中活性丧失速率随pH值升高而加紧，且25℃失活速率高于4℃。pH值为8.0时，20μmmol/lPMSF水溶液半寿期大约为85min，这表明将PMSF溶液调整为碱性（pH8.6）并在室温放置数小时后，可安全地给予丢弃。23．磷酸盐缓冲溶液（PBS）溶液【配制方法】在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl、1.44gNa2HPO4和0.24gKH2PO4,用HCl调整溶液pH值至7.4加水定容至1L，在15lbf/in2(1034×105Pa)高压下蒸气灭菌20min。保留于室温。24．1mol/L乙酸钾（pH7.5）溶液【配制方法】将9.82g乙酸钾溶解于90ml纯水中，用2mol/L乙酸调整pH值至7.5后加入纯水定容到1L，保留于-20℃。25．乙酸钾溶液（用于碱裂解）【配制方法】在60ml5mol/L乙酸钾溶液中加入11.5ml冰乙酸和28.5ml水，即成钾浓度为3mol/L而乙酸根浓度为5mol/L溶液。26．3mol/L乙酸钠（pH5.2和pH7.0）溶液【配制方法】在80ml水中溶解408.1g三水乙酸钠，用冰乙酸调整pH值至5.2或用稀乙酸调整pH值至7.0尊龙凯时，加水定容到1L尊龙凯时，分装后高压灭菌。27．5mol/LNaCl溶液【配制方法】在800ml水中溶解292.2gNaCl加水定容至1L，分装后高压灭菌。28．10%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液【配制方法】在900ml水中溶解100g电泳级SDS，加热至68℃助溶，加入几滴浓盐酸调整溶液pH值至7.2，加水定容至1L，分装备用。【注意】SDS微细晶粒易扩散，所以称量时要戴面罩，称量完成后要清除残留在称量工作区和天平上SDS，10%SDS溶液无须灭菌。29．20×SSC溶液【配制方法】在800ml水中溶解175.3gNaCl和88.2g柠檬酸钠，加入数滴10mol/lNaOH溶液调整pH值至7.0，加水定容至1L，分装后高压灭菌。30．20×SSPE溶液【配制方法】在800ml水中溶解17.5gNaCl、27.6gNaH2PO4?H2O和7.4gEDTA，用NaOH溶液调整pH值至7.4（约需6.5ml10ml/LNaOH），加水定容至1L，分装后高压灭菌。31．100%三氯乙酸溶液【配制方法】在装有500gTCA瓶中加入227ml水，形成溶液含有100%（M/V）TCA。32．1mol/LTris溶液【配制方法】在800ml水中溶解121.91gTris碱，加入浓HCl调整pH值至所需值。应使溶液冷至室温后方可最终调定pH值，加水定容至1L，分装后高压灭菌。【注意】如1mol/L溶液展现，应予丢弃并置备质量愈加好Tris。尽管多个类型电极均不能正确测量Tris溶液pH值，但仍可向大多数厂商购得适宜电极。Tris溶液pH值因温度而异，温度每升高1℃，pH值大约降低0.03个单位。比如：0.05mol/L溶液在5℃、25℃、和37℃时pH值分别为9.5、8.9和8.6。33．Tris缓冲盐溶液（TBS）（25mmol/lTris）【配制方法】在800ml蒸馏水中溶解8gNaCl、0.2gKCl和3gTris碱，加入0.015g酚并用HCl调至pH值至7.4，用蒸馏水定容至1L，分装后在151bf/in2(1.034×105Pa)高压下蒸汽灭菌20min，于室温保留。

　　【配制方法】X-gal为5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D半乳糖苷。用二基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml贮存液。保留于一玻璃管或聚丙烯管中，装有X-gal溶液试管须用铝箔封裹以防因受光照而被破坏，并应贮存于-20℃。X-gal溶液无须过滤除菌。本文档为【2021年超滤管使用方法和注意项目】，请使用软件OFFICE或WPS软件打开。作品中的文字与图均可以修改和编辑， 图片更改请在作品中右键图片并更换，文字修改请直接点击文字进行修改，也可以新增和删除文档中的内容。